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旋渦混合器提取質(zhì)粒DNA

更新時間：2013-09-09   點擊次數(shù)：4687次

從大腸桿茵中提取質(zhì)粒DNA的方法很多，其中的堿性別方法提取質(zhì)粒是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性存在差異而予以分離的。在強堿性條件下，染色體洲A和質(zhì)粒DNA均變性（雙鏈解開）。由于質(zhì)粒DNA是共價閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)，變性后兩條互補鏈不會*分開。當(dāng)溶液pH調(diào)節(jié)到中性時．質(zhì)粒DNA容易復(fù)性并溶解在溶液中，而染色體DNA不容易復(fù)性，互相繼繞．在利用臺式高速離心機進(jìn)行離心時極易和蛋白質(zhì)—3Ds復(fù)合物等一起沉淀下來。轉(zhuǎn)移出上演液，再用乙醇沉淀出其中的質(zhì)粒DNA。具體操作步驟如下：

 

    （1）接種一單菌落于100ml LB液體培養(yǎng)基中，加入50μl的氨芐青霉素，37℃振蕩培養(yǎng)8—10h，使培養(yǎng)達(dá)到飽和狀態(tài)。

    （2）取1.5ml培養(yǎng)液利用臺式高速離心機離心20s，沉淀用100μl GTE懸浮并于室溫放置5min。

    （3）加入200μl NaOH/SDS溶液，混勻，于冰上放置5min。

    （4）加入150μl KAc溶液，在MixMax旋渦混合器上振蕩2s，于冰上放置5min。

    （5）離心3min，然后吸取0.4ml上清液移入干凈的微量離心管中，加入0.8ml無水乙醇，室溫靜置2min。

    （6）室溫下通過臺式高速離心機進(jìn)行離心3min，（使用臺式高速離心機時一定要注意轉(zhuǎn)速、時間控制以及操作規(guī)范）用lml 70％的乙醇洗滌沉淀，然后真空于燥。

    （7）沉淀用30μl dd HO溶解，-20℃保存。

 

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